Pregabalín nie je GABAA ani agonista receptora GABAB.
Pregabalín je gabapentinoid a pôsobí inhibíciou určitých vápnikových kanálov. Konkrétne ide o ligand pomocného miesta podjednotky a28 určitých napäťovo závislých vápnikových kanálov (VDCC), a tým pôsobí ako inhibítor VDCC obsahujúcich podjednotku a28. Existujú dve podjednotky α2δ viažuce liečivo, α2δ-1 a α2δ-2, a pregabalín vykazuje podobnú afinitu (a teda nedostatočnú selektivitu medzi) týmito dvoma miestami. Pregabalín je selektívny vo svojej väzbe na α2δ VDCC podjednotku. Napriek skutočnosti, že pregabalín je analóg GABA, neviaže sa na receptory GABA, nekonvertuje sa na GABA alebo iného agonistu receptora GABA in vivo a priamo nemoduluje transport alebo metabolizmus GABA. Zistilo sa však, že pregabalín spôsobuje na dávke závislé zvýšenie mozgovej expresie dekarboxylázy kyseliny L-glutámovej (GAD), enzýmu zodpovedného za syntézu GABA, a preto môže mať určité nepriame GABAergické účinky zvýšením hladín GABA v mozgu. V súčasnosti neexistuje dôkaz, že účinky pregabalínu sú sprostredkované iným mechanizmom ako inhibíciou VDCC obsahujúcich α2δ. V súlade s tým sa zdá, že inhibícia VDCC obsahujúcich a2δ-1 pregabalínom je zodpovedná za jeho antikonvulzívne, analgetické a anxiolytické účinky.
Endogénne α-aminokyseliny L-leucín a L-izoleucín, ktoré sa chemickou štruktúrou veľmi podobajú pregabalínu a iným gabapentinoidom, sú zjavnými ligandami podjednotky α2δ VDCC s podobnou afinitou ako gabapentinoidy (napr. IC50 = 71 nM pre L- izoleucín) a sú prítomné v ľudskom cerebrospinálnom moku v mikromolároch koncentrácie (napr. 12,9 uM pre L-leucín, 4,8 uM pre L-izoleucín). Predpokladalo sa, že môžu byť endogénnymi ligandmi podjednotky a že môžu kompetitívne antagonizovať účinky gabapentinoidov. V súlade s tým, zatiaľ čo gabapentinoidy ako pregabalín a gabapentín majú nanomolárne afinity k podjednotke a25, ich účinnosť in vivo je v nízkom mikromolovom rozsahu a za tento nesúlad je pravdepodobne zodpovedná súťaživosť o väzbu endogénnymi L-aminokyselinami.

V jednej štúdii sa zistilo, že pregabalín má 6-krát vyššiu afinitu ako gabapentín k VDCC obsahujúcim α2δ podjednotku. Iná štúdia však zistila, že pregabalín a gabapentín majú podobné afinity k ľudskej rekombinantnej podjednotke α2δ-1 (Ki = 32 nM a 40 nM, v danom poradí). V každom prípade je pregabalín 2 až 4-krát účinnejší ako gabapentín ako analgetikum a u zvierat sa zdá byť 3- až 10-krát účinnejší ako gabapentín ako antikonvulzívum.